Odloučen od rodiny podnikl Livingstone v letech 1853-56 expedici, při níž podruhé dosáhl řeky Zambezi. Nejprve se vydal na západní pobřeží Afriky, odkud se vrátil a prozkoumal tok Zambezi až k ústí do Indického oceánu. Přitom objevil velkolepé vodopády, které nazval na počest britské královny Viktoriinými. Stal se tak prvním člověkem, který přešel Afriku v její jižní části. V roce 1856 se poprvé vrátil do rodné Británie, kde byl přijat jako slavný cestovatel…
Narodil se 19. března 1813 ve skotském Blantyre v rodině obchodníka s čajem a měl šest sourozenců. Již jako chlapec pracoval ve mlýně na bavlnu, ale každou volnou chvilku se věnoval studiu knih nebo poznávání přírody. Jeho rodiče, devótní křesťané, měli na jeho život rozhodující vliv, neboť ho přivedli k misionářské činnosti. Po studiích medicíny a řečtiny na universitě v Glasgowě odešel do Londýna, kde nabídl své služby Londýnské misionářské společnosti. Chystal se vypravit jako misionář do Číny, ale opiová válka, která vypukla v roce 1838, ho přinutila změnit cíl.
V prosinci 1840 vyplul spolu s Dr. Robertem Moffatem, nazývaným „pionýrský misionář Afriky“, do jižní Afriky. Nejprve pobýval na misijní stanici Kuruman v Bečuánsku (dnešní Botswaně), aby se naučil pravidlům jejího fungování. Zde poznal Moffatovu dceru Mary, s níž se roku 1845 oženil a vydal na sever zakládat misijní stanice Mabotsa a Kolobeng. Následující šťastné roky strávené v kruhu rodinném, kdy se intenzivně věnoval misionářské činnosti, narušil pouze útok lva, který mu zranil rameno.
Stále častěji se vydával na průzkum neprobádaných oblastí. V roce 1849 přešel poušť Kalahari navzdory tvrzení domorodců, že bílý muž poušť nikdy překonat nemůže, a objevil slané jezero Ngami. Roku 1851 se s celou rodinou vydal na sever, dorazil k řece Chobe a po jejím toku pokračoval až k Zambezi. Byl to významný objev, neboť do té doby byl znám pouze dolní tok řeky, o niž panovala domněnka, že pramení v Mosambiku. Po několika záchvatech malarické horečky se rozhodl poslat manželku se čtyřmi dětmi do Anglie, protože její zdravotní stav se nelepšil. Sám zůstal v Africe, aby naplňoval svůj cíl šířit evangelium mezi africkým obyvatelstvem.
Odloučen od rodiny podnikl Livingstone v letech 1853-56 expedici, při níž podruhé dosáhl řeky Zambezi. Nejprve se vydal na západní pobřeží Afriky, odkud se vrátil a prozkoumal tok Zambezi až k ústí do Indického oceánu. Přitom objevil velkolepé vodopády, které nazval na počest britské královny Viktoriinými. Stal se tak prvním člověkem, který přešel Afriku v její jižní části (z Luandy v Angole do mosambického Quelimane).
V roce 1856 se poprvé vrátil do rodné Británie, kde byl přijat jako slavný cestovatel. Vědecké společnosti mu udělovaly medaile a university čestné doktoráty. Roku 1858 se spolu se svou ženou a bratrem Charlesem znovu vydal do Afriky a pokračoval v průzkumech nitra afrického kontinentu. V roce 1859 objevil jezero Malawi. Na této expedici přišel v roce 1862 o svou milovanou manželku. O její smrti Livingstone napsal: „Bylo to poprvé v mém životě, kdy jsem si přál zemřít.“ Dokončil průzkum Zambezi, jejího přítoku Shire a oblasti řeky Rowumy. Přes Bombaj se vrátil v roce 1864 do Londýna.
Roku 1866 odplul opět do Afriky z cílem objevit prameny Nilu. Vypravil se ze Zanzibaru na západ a o rok později objevil jezero Tanganyika a Mweru. V roce 1868 dorazil k jezeru Bangweulu a zjistil, že z něho vytéká zdrojnice Konga. Tím objasnil otázku pramene tohoto veletoku. Skoro dva roky se zotavoval v Udžidži na břehu Tanganyiky a v roce 1871 se vydal na západ, objevil řeku Lualabu a správně stanovil, že patří do povodí Konga. V pokračování jejího průzkumu mu zabránili obchodníci s otroky. Musel se zcela vyčerpán vrátit zpět do Udžidži, kde se na podzim téhož roku setkal se sirem Henrym Mortonem Stanleyem, který se ho vydal hledat, protože byl prohlášen za nezvěstného. I přes zhoršující se zdravotní stav se v srpnu 1872 Livingstone vypravil hledat prameny Lualaby, ale 1. května 1873 v Ilale ho na břehu jezera Bangweulu dostihla smrt. Sluhové dopravili v únoru 1874 jeho ostatky na pobřeží. Se všemi poctami byl pohřben ve Westminsterském opatství v Londýně 18. dubna 1874.
Livingstone zahájil vědecký výzkum Afriky na jih od rovníku a prozkoumal velmi rozlehlé území. Zanesl do mapy tisíce přesně změřených bodů a kót, sestavil přesný popis tras svých cest, objevil množství dosud neznámých objektů i pořídil bohaté sbírky přírodnin. Jako misionář měl neobyčejně vřelý vztah k Afričanům bez jakýchkoliv rasistických předsudků a dokázal, že se bez nebezpečí může po Africe pohybovat i osamělý Evropan, pokud vnímá místní domorodce jako sobě rovné. Tím byl nejen velký cestovatel, ale i velký humanista.
Své zážitky Livingstone popsal v několika publikacích. Jako první vyšla roku 1857 v Londýně kniha nazvaná „Missionary Travels and Researches in South Africa“ (Misionářské cesty a výzkumy v jižní Africe), která jako jediná vyšla i v češtině ve zkrácené podobě pod názvem „Napříč Afrikou“, Praha 1924. Spolu s bratrem Charlesem napsal „Narrative of an Expedition to the Zambezi and its Tributaries“ (Vyprávění o expedici k Zambezi a jejích kmenech), Londýn 1865. H. Waller vydal Livingstoneův deník z poslední expedice v knize „The Last Journals of D. Livingstone in Central Africa“ (Poslední deník D. Livingstona ve střední Africe), Londýn 1874. Cestovatelovy dopisy i zápisky zpracoval I. Schaper v dílech „Livingstone‘s Missionary Correspondence 1841-56“ (Livingstonova misionářská korespondence 1841-56), Londýn 1961 a „Livingstone‘s African Journals 1853-56“ (Livingstonovy africké deníky 1853-56), Londýn 1963.